Investigación

La intención del equipo fue recolectar algunas muestras de la flora: plantas y algas marinas de importancia comercial que habitan en los ecosistemas de manglares y arrecifes de coral, para posteriormente analizar la autoflourescencia que esta flora manifiesta, usando equipos de microscopía confocal.

Entrada del Canal de Panamá en el lado caribeño

Existe un gran conjunto de ecosistemas de arrecifes de coral y manglares entre Bahía Margarita, cerca de la ciudad de Colón, y María Chiquita.

Entre mayo y junio de 2018, Gloria Batista de Vega dirigió un equipo de científicos que llevó a cabo una colección de plantas marinas cerca de la entrada norte del canal de Panamá, (ANEXO 1. Permiso de Recolecta otorgado por Mi Ambiente, Panamá). La intención del equipo fue recolectar algunas muestras de la flora: plantas y algas marinas de importancia comercial que habitan en los ecosistemas de manglares y arrecifes de coral, para posteriormente analizar la autofluorescencia que esta flora manifiesta, usando equipos de microscopía confocal. Estas áreas han sido visitadas y se han realizado diferentes recolecciones de algas marinas ya referenciadas en varias publicaciones desde 1962 (Batista, 2009). Están ubicadas cerca de un gran conjunto de ecosistemas de arrecifes de coral y hábitats de manglares entre Bahía Margarita, cerca de la ciudad de Colón y María Chiquita.

El estudio cubrió más de 11 kilómetros de costa. Algunos sitios visitados han sido denominados por los géneros de coral, tales como Agaricia y Porites. Se pudo comprobar que eran abundantes y saludables, además de no presentar indicios de blanqueamiento. Las algas coralinas, por ejemplo Peyssonnelia y otras algas que viven en la corteza de algunos corales, están presentes, en un gran porcentaje, en los arrecifes del área (Brooks, 2016).

A cada macroalga recolectada en este estudio se le dió un número de colección por muestra recolectada, sin tener en cuenta las categorías fundamentales taxonómicas de las algas, con el propósito de que los análisis de fluorescencias fueran lo más auténticos posibles. Las muestras fueron separadas en cuatro réplicas llevando el mismo número de recolecta. Las muestras de la primera réplica se colocaron vivas en incubadoras, en el laboratorio marino de Rodman, de Gracilarias de Panamá S.A. para su posterior análisis en el Microscopio de fluorescencia. En la segunda réplica, las muestras fueron colocadas en monturas conservando el mismo número de recolecta para conservarlas como parte del banco genético de algas marinas del laboratorio. La tercera replica fue exportada al “Departamento de Botánica, Museo Nacional de Historia Natural, Smithsonian Institution. Washington D.C.” de conformidad con los permisos de exportación concedidos por el Ministerio de Ambiente de la República de Panamá (Anexo 2, Permiso de Recolecta otorgado por Mi Ambiente, Panamá; Anexo 3, Carta de confirmación de la participación del Atlas número AG-902-17 de la ARAP en el Atlas y Anexo 4, Permiso de Importación PCIP-18-00026 por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de América, (USDA). Por último, las muestras de la cuarta réplica se secaron en gel de sílice para futuros códigos de barras de ADN.

Para armar las figuras, fotos e imágenes en los resultados las separamos por divisiones taxonómicas siguiendo el orden por número de cada alga recolectada.

Estudio fotográfico en 3D de especies elegidas para análisis confocal

Las fotografías de las algas fueron tomadas en el Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales en Panamá, con una cámara Canon EOS 6D, con un sistema integrado que toma las fotografías con diferentes distancias de enfoque. Con ello se obtuvo una serie de varias fotografías. Se utilizó el lente Canon Compact-macrolens EF50mm 1:25, en combinación con un Tamron SP AF Tele-converter (140F-CA 1.4x). Luego de tener la serie de fotos, se utilizó el software Helicon Focus, para reconstruir una imagen 3D que fue editada posteriormente con el software Adobe Photoshop Elements, 2018.

Preparación, observación de muestra y obtención de imágenes confocales

Se obtuvieron cortes transversales de 2 a 3 mm de grosor. Las micrografías fueron tomadas, esencialmente, del borde o pared del alga, que es la zona con la mayor cantidad de células con fluorócromos. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser Olympus FV1000 (Fig.10). El método empleado para la captura de información fue la detección de la emisión de la autofluorescencia generada en el tejido vegetal por excitación con tres fuentes láser, aplicada a diferentes longitudes de onda: L473nm, L559nm y L635nm. Las observaciones se realizaron con lentes objetivos de 10x, 20x y 60x (aceite). Se tomaron juegos de micrografías en diferentes planos focales (Z). Las imágenes obtenidas se guardaron en formato TIFF. El stock de fotos fue procesado mediante programa ICY de edición para la obtención de imágenes 3D.

Olympus modelo FV1000, secuencial espectral.

El equipo cuenta con cuatro láseres de diodo (L405nm, L473nm, L559nm, L635nm), cuatro canales y dos detectores con platina motorizada (foto cortesía del Dr. Armando Castillo, Centro Neurociencias INDICASAT, Laboratorio de Microscopía Electrónica y Confocal del Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales, en Panamá).

Configuración de trabajo del microscopio confocal de barrido láser

Para la obtención de la mejor señal fluorescente en las muestras, se realizó un escaneo o barrido láser en el espectro de emisión fluorescente en muestras controles de algas de los géneros Gracilaria, Eucheuma y Laurencia. En función de esto, se generó la configuración del software para aplicar en la observación y toma de fotografías a todas las muestras de la colección. Fueron seleccionados filtros del fluoróforo Cyanina que presentaron las mejores ventanas para la captación de la señal fluorescentes en las muestras controles. Los filtros Cy2, Cy3.5 y Cy5 se configuraron con los láseres 473nm, 559nm y 635nm. Se logró obtener la autofluorescencia en sección de un borde de alga marina expuesta a cuatro láseres de diodos del microscopio.

Espectros fluorescentes de las muestras control y de los filtros para captura de señales.

Se realizó un barrido del espectro fluorescente. Tenemos aquí los espectros de las algas rojas de los géneros Gracilaria, Eucheuma y Laurencia (curva en color rojo) y se seleccionaron los filtros para el fluorócromo Cyanina (CY2, CY3.5 y CY5), para recoger la mayor intensidad de emisión.

Conjunto de fotografías tomadas a una muestra, para la selección del láser por emplear. A: láser 405nm, B: láser 473nm, C: láser 559nm, D: láser 635nm.