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La microscopía confocal

La microscopía confocal es una tecnología derivada de la microscopía de fluorescencia que agrega, además de un poderoso software, el uso de luz láser de diferentes longitudes de onda; aperturas (pinole) con dispositivos concentradores de luz que la direccionan hacia el punto focal de observación.

La Microscopía Confocal

Microscopía de fluorescencia y confocal láser

Comparación de dos imágenes de una muestra de madera. En la vista superior, imagen obtenida mediante un microscopio Nikon E600 con lámpara de mercurio, y en la vista inferior, con un microscopio confocal Olympus FV1000, láser 473nm y 561nm. Obsérvese la diferencia en cuanto a la resolución de las imágenes (Instituto Smithsonian, Panamá).
Esto permite obtener imágenes solo en foco. La luz láser (fuente de iluminación) induce la fluorescencia en la muestra, que es capturada por detectores y procesada mediante el software que permite, además, generar una o varias imágenes de alta resolución y reconstruirlas como una imagen 3D. La proyección será una imagen totalmente en foco, a diferencia del microscopio de fluorescencia, que recoge la fluorescencia proveniente tanto del punto de foco como de los puntos fuera de foco en el plano lateral y axial, y da como resultado una imagen sin definición o desenfocada.

El microscopio confocal fue desarrollado en la década del 50 por Marvin L. Minsky, considerado el padre de la inteligencia artificial, quien pensaba que podía ser una herramienta para sus estudios. Para Minsky, el cerebro humano era un computador; los seres humanos, máquinas evolucionadas, y la inteligencia humana, el resultado del devenir natural de las cosas. Pensaba que al conocer mejor el funcionamiento del cerebro, construiríamos máquinas más inteligentes que, a su vez, nos ayudarían a entender mejor el cerebro.

Minsky quería obtener imágenes de redes neuronales de tejido cerebral en preparaciones no teñidas, en momentos en que ocurrían los eventos biológicos en los sistemas vivos. El microscopio confocal no generó el impacto esperado inmediatamente, debido al poco desarrollo tecnológico que existía en ese momento para dar soporte al invento, tales como la falta de fuentes de iluminación y software. Posteriormente, con la aparición de softwares poderosos, el descubrimiento de las proteínas fluorescentes y los avances en el área de la inmunología, se convierte en una verdadera herramienta en el área de la medicina y diferentes ramas de la biología. En la actualidad, se logran imágenes de alta resolución de estructuras biológicas marcadas con fluorócromos específicos y para la aplicación de métodos de naturaleza no invasiva, conservando las muestras sus características originales.

La resolución se alcanza mediante técnicas de filtrado que eliminan la luz que proviene de planos fuera de foco. Esto permite controlar la profundidad de campo y, además, obtener series de imágenes del espécimen cambiando el plano del foco. Son visibles las regiones que quedan enfocadas; el resto del preparado aparece en negro. Por lo tanto, la aplicación de este tipo de microscopía no está limitada a muestras delgadas (Claxton et al. 2006).